成像技术作为一种能准确、及时诊断脑卒中、研究其生理特征和病理机制的重要手段,已经经历了一个多世纪的迭代。大脑中密集分布的细胞之间的相互作用是三维的,但传统可视化方法带来的二维平面图像只显示少数细胞,而忽略了切片外的连接。分辨率的提高可以带来更微观和更底层的视图。如今,微米甚至纳米级的直观3D图像对脑卒中的研究越来越重要。近年来,3D成像技术得到了快速发展。随着成像介质的彻底改革和成像模式的创新,分辨率得到了显著提高,研究人员能够对大体积样本进行整体观测,实时监测微小体素,并对空间参数进行定量测量。本文简要总结目前高分辨率3D成像技术在脑卒中中的应用方法。

　　脑卒中是一种主要发生在脑微血管系统的缺血性或出血性疾病,可导致脑血管系统的损伤和神经功能的不可逆损害,甚至死亡。更好地了解其发病机制可以帮助找到更有效的治疗方法。然而,向多个方向伸展的神经元和血管构成了一个复杂的空间网络。脑卒中的研究不再仅仅满足于二维平面上的信息,其更重要的特性只能在三维图像中得到证明。使用具有多种分辨率(从纳米级到微米级)的微观观察方法进行的时空研究提供了超越生化分析和基因检测视角的新见解。凝胶电泳和色谱等生化分析以及聚合酶链式反应等基因检测可以定量或定性地了解区域效应分子,以解释病理变化,但缺乏空间分布和关系的可视化。因此,无法观察到神经元和血管之间复杂的空间相互作用。几十年来,设计用于可视化的显微镜将其关注点从平面关系转移到空间关系,甚至转移到空间动力学,导致成像从2D发展到3D,甚至4D(3D+时间)。显微镜和超高分辨率显微镜技术确实有助于在纳米级微观水平上解释大脑,用于发现新的细胞内结构、分析生物分子相互作用和量化分子计数。在微米级水平(1-10 μm),仍然需要一个3D成像平台来解决硬组织和软组织之间的空间关系,并提供3D定量表征。新成像介质(如同步辐射)或新方法(如光片显微镜)的使用大大提高了3D成像的分辨率。基于光、声学、核磁共振等不同方法,高分辨率三维成像技术正逐步应用于脑卒中研究,以解析大脑精细结构、功能和代谢状态等。

　　同步辐射(SR)的光谱范围很广,从红外线到x射线,x射线是生物医学中最常用的同步辐射源。当存储环的磁场以亚光速改变电子的运动方向时,同步辐射x射线沿轨道切线方向发射电磁波。它具有高强度、单色性、准直相干性和高空间分辨率的特点,比传统的x射线吸收成像高1000倍左右。目前全世界有20多个同步加速器,分辨率可达到微米级甚至亚微米级。SR为脑卒中微血管研究提供了选择。常规SR使用吸收血管造影,吸收血管造影的3D成像主要用于体内。免疫组化染色只能显示脑血管的数量,而不能显示灌注血管的数量,而SR可以实现脑微血管的动态观察。研究人员在大鼠体内以9 μm分辨率连续实现了血栓溶解和再通的动态检测和评估。

　　相位对比成像(PCI)可以检测微米或亚微米微血管,无需血管造影。相位对比3D成像主要用于体外,它更适合卒中时的神经血管网络,且与吸收成像相比,它无需对比剂即可提供更多的多维度和多尺度信息。与吸收对比成像(ACI)不同,PCI对血管结构具有良好的适用性,因为ACI中造影剂的不完全填充或泄漏将不可避免地影响所获得图像的质量。除了血管结构和血流动力学外,PCI还可用于血管生成的半定量研究。结果发现,Dl-NBP治疗的大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠缺血性梗死周围区域的灌注血管密度高于溶剂对照组,表明丁基苯酞治疗促进了MCAO梗死周围区域的血管生成。在 MCAO 小鼠中,ILPCI 用于3D血管结构的重建,以显示血管树按缠结的方式排列形成网络,并识别出直径约11.8 μm的血管。SR 3D成像用于测量微血管参数,包括血管表面积、血管节段数和血管分叉数,像素大小为5.2 μm。除了微血管网络和神经系统的3D重建外,基于SR的多种其他技术还可以结合起来,以高分辨率的方式捕获各种类型的数据。例如,SR红外光谱(SR-IR)或SR微x射线荧光(SR-μXRF)可以观察神经元和血管的生化特性,而这种发生在神经血管网络中的代谢变化是脑卒中的标志物。

　　SR重建正常大鼠脑海马3D血管结构。(a,b)通过SR-ILPCI重建,从全脑(a)中提取右侧海马三维网络的空间结构分布并准确勾勒(b)(比例尺=600μm)。(c)海马血管直径渲染识别不同直径血管的分布。(d)海马内脑内血管的原始分布,具有连续的伪彩色变化,描绘了血管直径的分布谱,范围从10μm到100μm(深蓝色)(比例尺=700μm)。

　　双光子显微镜(TPM)使用近红外(NIR)光代替传统激光共聚焦显微镜使用的可见光或紫外光。在非线性光学过程所需的高光通量下,荧光分子同时吸收两个长波光子,到达激发态后再发射一个波长较短的光子,以此实现成像。由于双光子或多光子成像需要高光子密度的激发光,因此只能激发焦点内部和周围体积非常小的荧光分子,这使得双光子和多光子显微镜(MPM)具有非常高的三维分辨率。程和平团队设计的快速高分辨率双光子显微镜可以实现0.64 μm的水平分辨率、3.35 μm的轴向分辨率和40 Hz的成像帧频。与传统的激光共聚焦显微镜相比,n光子吸收概率迅速降低,因此光漂白和光毒性仅发生在焦点处。

　　TPM在脑卒中中的应用主要是探索活体哺乳动物的大脑信息,激光共聚焦扫描显微镜可以扫描表层下约100 μm的结构,但神经元群等结构的成像需要更深的穿透力,即穿透到表面下约300-500 μm。TPM/MPM可以通过提供高分辨率、非侵入式的深部组织观察来解决这一问题。但需要扫描大脑,必须将覆盖的不透明颅骨减薄至15 µm厚,或部分移除颅骨以形成颅窗。现在可以通过改进颅窗盖玻片来实现新皮层的皮层下成像,使球面像差的影响最小化。荧光染料的给药方法包括静脉给药、电穿孔和病毒转导;对于脑血管标记,静脉注射荧光染料可以有效地从器官上染色整个血管树。TPM钙成像可用于研究脑卒中后胶质细胞对神经元活动的影响。研究人员设计了一种彩色多光子系列(ChroMS)显微镜,以提供高对比度多色成像,并跟踪了1.2×2×1 mm3区域内1055个星形胶质细胞形成的261个发色团,体素大小仅为0.54×0.54×1.5 µm3。此外,对于更深的部位,使用双光子吸收荧光探针,可以对皮肤下超过1 mm深的微血管进行3D成像。MPM能够在更深的大脑区域进行高分辨率成像。研究人员成功地使用三光子显微镜在约900 μm的深度、以4.4 μm分辨率成像了小鼠海马和用红色荧光蛋白标记的神经元的血管结构。

　　三光子显微镜观察小鼠视皮层深处与血管和白质相关的细胞。(A)三光子图像体积3D重建的侧视图,显示了相对于血管和白质的细胞场。俄勒冈绿色标记的第5-6层细胞以黄色显示,用德克萨斯红葡聚糖标记的血管以洋红色显示,用THG成像的皮质白质以青色显示。x-y-z体积尺寸:375µm×375µm×1100µm。(B)位于脑表面下方750µm处的单z平面三光子图像,显示标记的细胞和血管。(C)大脑表面下900µm处白质的单z平面三光子图像。

　　TPM的另一个典型应用是在自由移动的小鼠上小型化使用,弥补了在长期行为或社会行为研究中台式显微镜的不足。研究人员使用头戴式微型TPM在视野中观察到约200个标记有绿色荧光蛋白的少突胶质细胞,其直径为240 μm,横向分辨率为1.8 μm,轴向分辨率为10 μm。然而,TPM的小型化仍然需要有效的荧光收集、紧凑和快速的扫描机制以及减少运动伪影。

　　由于激发光的光漂白和光毒性效应,大多数光学成像方法无法实现活细胞的长期观察和细胞内生命活动的记录。光片显微镜(LSM)技术已成为成像技术发展的重要转折点。采用直角排列的激发器和检测物镜以形成分层光,分离激发和发射光路以确保特定平面的选择性激发,因此减少了无效暴露、光漂白和光毒性。LSM用于卒中脑的大组织时,会受到伪影的限制。例如,如果样品含有高密度结构,如阻挡激发光的色素,或导致光散射和照明不均匀的脂质,则会产生一些暗线。组织透明化是目前常见的解决方案。其提高穿透力和减少光散射的效果非常适合脑组织,尤其是整个大脑的3D成像,因此可以在不进行物理切片的情况下获得整个大脑的3D图像。目前常用的组织透明化技术可分为三种方法:疏水性、亲水性和水凝胶。

　　LSM在脑卒中的神经结构和功能成像研究中发挥了重要作用。研究人员能够以单细胞分辨率进行全脑功能成像和光遗传学研究。观察对象由啮齿动物换成了人类。使用超越衍射极限的超显微技术将使分辨率提高到纳米。扩展显微镜(ExM)和点阵光片显微镜(LLSM)的联合使用能实现以60×60×90 nm3的分辨率可视化和量化神经群、亚细胞结构和突触连接。结合单分子定位技术获得的横向平均精度可达到7.2 nm。非侵入性研究一直是LSM的目标。通过颅骨窗扫描共焦对齐平面激发(SCAPE)显微镜可以监测清醒和自由活动小鼠大脑中的神经网络活动,并在140 μm处区分5-10 μm深的单个毛细血管。SCAPE2.0穿透深度可达450 μm。近红外II窗口LSM进一步实现了头部深度为750 μm的实时成像。

　　大脑的血管系统也可以通过染色填充策略充分利用LSM,例如皮层微血管的特殊形状,以及脑缺血后血管的变化。组织透明化的引入提供了血管系统的3D成像。在注射异硫氰酸荧光素(FITC)结合白蛋白并通过光片显微镜以评估缺血脑中大规模微血管的实验中,研究人员以2 µm的分辨率测定了局灶性脑缺血后的微血管网络特征,包括微血管长度密度、分支点密度和微血管迂曲度。为了减少常规分子表征血管成像的假阴性,新开发的SeeNet方法改进了染料,以实现几乎整个脑微血管的3D成像。神经元和血管的同时3D成像是脑卒中的一个重要发展方向。LSM可以同时定性和定量地研究神经血管网络,且已被用于神经退行性变和神经发育。不过,LSM仍然需要一种能够以小于1 μm的同向分辨率成像大样本的技术,以及一种更快、更精确的处理数十兆字节以上数据集的算法。

　　脑血管的大规模分子分型兼容3D成像。(A)在SeeNet处理过的大脑中,整个血管的光片荧光显微图像(1.6倍变焦,×0.63物镜,数值孔径:0.15,工作距离:87mm)最大投影到一张叠加照片中。投射血管显示为红色。绿色显示用抗α平滑肌肌动蛋白(抗αSMA)免疫标记的小动脉。比例尺=1mm。(B)从软脑膜到海马的血管系统共聚焦图像的最大投影。洋红色显示皮质-海马血管路径。比例尺=100μm。(C)相同区域中的抗αSMA免疫信号以绿色显示。比例尺=100μm.(D)皮质-海马血管路径的3D渲染视图。

　　脑卒中中深部神经和血管的准确观察越来越重要,那么能否将成像与切片相结合,从而克服成像深度限制,生成全脑的高分辨率3D图像呢?骆清铭团队设计的显微光学切片断层成像(Micro optical sectioning tomography,MOST)是一种新型神经光学成像系统,它可以同时扫描由金刚石刀切割的超薄切片进行光学成像,并获得高通量的亚微米脑数据。当组织切片厚度小于光学衍射极限时,轴向分辨率为切片厚度,横向分辨率由光学成像配置决定。MOST允许对神经元和神经元连接进行3D成像,以重建体素大小为0.33×0.33×1.0 μm3的小鼠大脑。脑血管网络的3D在以微米为分辨率定量分析微血管分布方面也显示出巨大的优势。改进的Nissl染色方法可以同时成像脑细胞和血管造影,分辨率为1 μm体素大小。在MCAO小鼠中,可获得0.35×0.4×1 µm的体素分辨率,以重建微血管。病毒标记物与荧光MOST(fMOST)的结合可以显示整个大脑中单个神经元的输入,为光遗传学提供了可靠的选择,成像速度也得以提高,在1.30×1.30×0.92 μm3的体素大小下,切片厚度为40 μm,无光学间隙的情况下,可在一小时内对整个小鼠大脑进行成像。缺点是数据集太大,从而使数据处理更加困难。

　　结合全新策略的切片和成像显示出巨大的应用潜力,基于这一概念出现了多种技术,如串行双光子断层成像(STP)、块面串行显微成像(FAST)。FAST分辨率可达0.7×0.7×5 μm3,图像采集间隔为50-100 μm,它的快速成像能力将小鼠大脑成像时间减少到2.4小时。研究人员用FAST以50 nm的分辨率分析了急性缺血性中风患者血栓的超微结构。STP还可以以微米和亚微米的分辨率对大脑进行3D成像。后来的研究更加深入,研究人员使用STP追踪CD8+T细胞,以可视化整个脑卒中后神经炎症,并监测B细胞的迁移,以观察中风后的神经发生和功能恢复。

　　NBP促进血管密度,改善血管网络。MCAO后15天,大脑皮层(A)、纹状体(B)和海马(C)的fMOST重建脑血管网络的代表性图像。(A)、(B)和(C)中a为溶剂对照组的冠状面投射图,b为NBP治疗组和a同层的冠状面投射图,c-f是a和b方框区域中血管结构的原始图像,g-j分别是c-f的三维重建脑血管图像,g和h为溶剂对照组,i和j为NBP治疗组,h和j为缺血区,i和j为对侧区。(D)缺血半球血管长度密度(a)和血管体积分数(b)的统计分析(每组3例)。

　　光学相干断层成像(OCT)是一种血管内成像方法,它利用近红外光通过干涉测量反射或反向散射光的幅度和延迟来生成图像。OCT之所以脱颖而出,是因为它能提供微米级分辨率的脑深部组织3D成像、几毫米的合理视野和可行的时间分辨率,从而实现实时测量。传统的3D OCT起初是用于眼科,分辨率限制在约10 μm。依靠对血细胞的追踪功能,它已逐渐被引入脑血管成像。在脑卒中中,OCT最有希望的领域是血流动力学。光学多普勒层析成像(ODT)将激光多普勒流量计与OCT相结合,允许在大视场(例如,2×3 mm2,深度>1 mm的体积)上对脑血管网络进行3D可视化,并对脑血流(CBF)进行定量测量。

　　激光散斑成像(LSI)是一种全场成像技术,用于使用简单的设备绘制具有高时空分辨率的血流图,其中较高流量的区域由较低的散斑对比度值表示。LSI可以分辨单个血管,并提供CBF的相关测量,可用于脑缺血半暗带等区域。它本身的分辨率为100 μm,很少单独用于3D成像。另一个限制是成像深度较浅,但使用显微内窥镜可以在大脑皮层下区域进行延时血流检测。LSI测量血流、血容量和血红蛋白氧合的变化,因此它可以与OCT结合,以10 μm分辨率同时显示皮层下0.7-0.9 mm处血管的血流动力学和氧合作用。此外,结合LSI、OCT和钙荧光成像的多模式成像可以同时检测动物大脑的皮层血流动力学、脑代谢和神经元活动。

　　除了光学3D成像技术以外,还有一些其他的3D成像技术,也广泛应用于脑卒中的研究中,如光声成像和核磁共振成像(MRI),本文不做重点介绍。

　　脑卒中的生理过程是基于神经和血管系统之间紧密而协调的关系。“神经血管单位”(NVU)的概念侧重于神经活动和血流之间的耦合,以解释神经元信号如何调节附近的微血管以支持大脑功能。同时,神经元和血管共享的分子通路在血管对神经系统稳态的影响中发挥作用。因此,神经血管结构和功能成像对于探索脑卒中的生理或病理过程具有重要意义。几十年来,许多3D成像技术在分辨率方面得到了发展或改进,但也引发了对这些技术的质疑。

　　为了符合生理状态,需要研究清醒状态下的神经和血流活动。荧光标记的TPM和LSM需要准备颅骨窗,具有侵入性。而PAI和MRI是无创的。传统方法如通过近红外窗口的荧光成像,结合千乘镜像自主研发的颅骨透明化技术,也可产生无创、高分辨率的三维图像,主要用于脑血管及血管内红细胞流动的监测。对活体的观察仅局限于浅层结构,而深层结构或对大型动物(如人类)的观察则需要更深的穿透力。累积散射限制了光学显微镜的穿透深度。TPM的深度比LSM的深度大,可以达到1 mm。通过近红外窗口,许多光学显微镜技术提高了穿透深度,最大穿透深度约为3 mm,但仍然只能观察浅表神经和血管。

　　目前,我们同时拥有纳米级和宏观的观察手段,却忽略了微米级的空间关系;我们有很多分别监测神经和血管的技术,但我们仍然无法很好地观察和解释神经-血管耦合。与此同时,我们越来越意识到脑卒中中神经和血管系统之间的密切关系,因此高分辨率3D成像不可避免地成为脑卒中进一步研究的关键。