衰老是指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象，包括生理性衰老和病理性衰老。前者指成熟期后出现的生理性退化过程，后者是由于各种外来因素所导致的老年性变化。在世界范围内逐渐走向老龄化的社会背景下，对衰老及衰老相关疾病的研究具有十分重要的社会意义。

　　为了阐明衰老的机制、发现衰老相关疾病诊断标志物并开发衰老相关疾病治疗药物，研究者开展了大量分子层面的研究，其中基于抗体芯片的蛋白质组学技术可分析和阐明蛋白质水平的免疫应答、信号通路中的关键因子而被许多研究者青睐。在本文中，我们对抗体芯片技术平台及其在衰老机制和衰老相关疾病中的相关研究进行整理汇总，为衰老相关蛋白质组学研究提供参考和借鉴。

　　一、抗体芯片技术介绍

　　1. 抗体芯片技术：抗体芯片又称为抗体微阵列(antibody array)，是一类特殊的蛋白质芯片，它是将多种特异性抗体固定在玻片或其他载体上，利用抗原-抗体作用与来自样品中的目的蛋白靶向结合，之后通过样本的荧光或荧光标记的第二抗体产生的结合信号实现对样品中特定蛋白含量的检测的一种技术平台。通过抗体芯片技术可以一次性对样品中上百种乃至上千种蛋白质进行定性、定量分析，实现蛋白质组的高通量分析。

　　2. 抗体芯片分类：抗体芯片具有多种类别，如根据所用的载体类型可分为固相芯片和液相悬浮芯片两大类，前者采用的载体主要有硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、玻片及多孔板，后者采用的载体为微球，其捕获抗体、检测抗体及待检物均处于溶液状态，故也被称为液态芯片;而根据检测原理可分为双抗体夹心法芯片和标记法芯片，前者采用荧光标记的第二抗体检测，后者是将样品中的蛋白标记荧光而实现检测;根据性能则可分为定量芯片和半定量芯片，前者可提供样品中检测蛋白的浓度数值，后者则以蛋白的检测信号表示其含量水平;为方便不同领域的使用，往往还将芯片按照不同通路和抗原类型分类，如凋亡相关芯片、肥胖因子芯片、炎症因子芯片等。目前，商品化固相芯片以RayBiotech和R&D Systems为主，商品化悬浮芯片则以Bio-Rad和Millipore为主。

　　对于定量芯片，通过其标准曲线可以直接计算样品中蛋白的浓度，对于半定量芯片则需要依据采集的荧光信号，以其强度值进行统计分析。芯片数据一般首先进行归一化处理，以消除不同芯片、检测实验间的误差。数据归一化的依据一般是芯片上预设的信号强度不同的几个校准点，依据不同芯片间质控点的强度，对每张芯片分别给出不同的校准系数。在商品化的抗体芯片中，这个过程可以借助厂家提供的软件自动完成。在完成归一化处理后，就可读出不同处理和生物学重复中各目的蛋白的检测值，之后可以通过各类统计检验、强度变化值来筛选差异蛋白，发现变化特征。数据结果可以采用火山图或热图的方式进行图形化呈现，也可进一步以聚类分析、主成分分析、通路富集分析进行数据挖掘。

　　4. 抗体芯片技术优势：虽然基因组测序、转录组测序、核酸芯片等技术可以对基因水平的变化进行研究，然而蛋白质作为基因功能的行使者，其表达水平比核酸能更加直接地反映器官、组织或细胞的生理、病理状态。另外，蛋白质往往存在大量的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化和乙酰化等，且修饰的变化可能与疾病的发生发展密切相关，这些信息是基因组技术无法提供的。而抗体阵芯片技术则既可以检测蛋白质组的丰度变化，以评估蛋白质水平变化与某些生理病理变化之间的相关性，又可以检测蛋白质上的翻译后修饰及其变化。

　　抗体芯片技术与质谱技术均能实现蛋白质组的高通量分析，视不同需求这两种技术各有优势，质谱技术以无需预制专门抗体和极其强大的高通量检测能力见长，且灵敏度高，消耗样品量少。抗体芯片也有其独到之处：首先，抗体芯片技术在样本处理上较为简单，无需对蛋白质进行酶解，因此获得的是完整蛋白的准确浓度，便于统计和分析;其次，目前抗体芯片产品种类比较细化，有较多功能性抗体芯片，如针对蛋白质修饰的芯片、针对细胞因子的芯片等，可以根据研究者的兴趣进行选择;最后，抗体芯片检测时无需富集即可完成对于蛋白质修饰、细胞因子等低丰度蛋白质的检测，敏感度可以达到飞克每毫升，对于血液等成分复杂的体液样本方便有效。

　　二、抗体芯片技术在细胞老化机制研究中的应用

　　细胞老化的初始定义是指细胞随着培养时间的延长丧失了增殖能力的现象，称之为复制衰老(RS)，此外，外来应急刺激，如化疗等基因毒性刺激也可诱导细胞老化的发生，称之为原癌基因诱导的老化(OIS)。老化细胞的一大特征是可以通过分泌炎症细胞因子和趋化因子而对周围细胞产生影响。这种分泌细胞因子而形成的表型，称为老化相关分泌表型(SASP)[1]。因此，抗体芯片技术以其对细胞因子的强大分析能力而成为阐明SASP表型、细胞衰老机制及其与肿瘤发生的相关性的良好平台。

　　2008年，Jean philippei coppe等人即借助抗体芯片对老化细胞分泌的细胞因子进行了定量分析，他们发现通过基因毒性(电离辐射)诱导的人成纤维细胞老化模型中可分泌大量炎症细胞因子。这种老化相关炎性表型(SASP)在初始阶段缓慢进展，只有当DNA损伤累积到一定数量级之后，细胞才会发生老化。与细胞模型结果一致的是，SASP在肿瘤化疗病人的细胞中同样存在，而反过来，成纤维细胞中的SASP可诱导细胞EMT特征，促进正常细胞向肿瘤细胞转变。Jun C. Acosta[2]等人发现趋化因子受体CXCR2缺失可以减缓细胞的老化、延长细胞的生长周期、降低细胞内的DNA损伤响应等过程，而高表达CXCR2则可引起细胞的早衰性异常，该过程依赖于P53。为了进一步研究CXCR2是如何减缓细胞衰老的，研究者对衰老细胞的分泌蛋白进行了细胞因子分析，发现14个细胞因子的表达量随着细胞的衰老而显著升高，其中IL-8与RGO的表达量变化最为明细。通过shRNA抑制IL-8与RGO的表达后，发现CXCR2的表达量下调，提示趋化因子IL-8与RGO可能是CXCR2引起细胞衰老的协同作用蛋白，在细胞衰老中发挥关键作用。该研究认为，衰老的细胞可能激活了自身的蛋白分泌过程，CXCR2与其中分泌的趋化因子结合加剧了细胞的老化。

　　细胞因子可能通过调节蛋白酶体活性而调控细胞老化[3]。有研究者通过敲除一个28KDa蛋白酶体激活因子蛋白REGγ构建了早衰小鼠模型，并对早衰小鼠进行了基于抗体芯片的蛋白质组进行分析。该抗体芯片含有磷酸化及全蛋白抗体，可以筛选磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白水平的变化。通过比较正常小鼠和模型小鼠蛋白质组的改变，研究者发现在缺陷小鼠中CK1蛋白发生了明显上调，说明CK1蛋白受到REGγ的调控。进一步对CK1蛋白的一个亚型CK1δ进行基因敲除、活性抑制、免疫共沉淀等分析，发现REGγ可能通过CK1δ-Mdm2-p53通路调控细胞的老化过程。

　　最近，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)被发现在组织衰老及肿瘤发生中发挥重要作用，NAD+及其合成过程的限速酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)的水平在复制性细胞老化和组织老化过程中均呈现显著下调，而当添加NAD+合成所需的前体物质烟酰胺单核苷酸(NMN)和烟酰胺核苷(NR)时，细胞老化及其相关病理性异常被延缓[4,5]。为了研究NAD+代谢影响细胞衰老的机制，Timothy Nacarelli等人开展了NAD+代谢相关功能研究，发现在老化细胞模型中HMGAS是NAMPT的调控蛋白，而通过抗体芯片等研究方法，研究者证明细胞内HMGAs/NAMPT/NAD+信号轴可能是NAD+代谢影响细胞衰老的途径，其中NAMPT对NAD+合成过程的调控可以控制细胞老化过程中SASP的强度[6]。

　　三、抗体芯片技术在衰老相关疾病研究中的应用

　　1. 阿尔兹海默病研究：阿尔兹海默病(AD)在65岁以上的老年人群中发病率超过10%，是一种重要的衰老相关疾病。AD一经确诊，往往已经经历了较长时间的疾病进程，因此对AD的早期诊断非常有意义。有研究表明AD的发生与免疫及感染系统的异常之间具有相关性[7]，因此，细胞因子抗体芯片被用于阿尔兹海默病(AD)的诊断标志物的发现。Sandip Ray等人对259例来自于具有早期脑损伤症状、晚期AD以及正常人群的血浆样本中的细胞因子进行了分析，发现了其中18种蛋白质的表达水平在AD及其对照人群中有显著的差别，而进一步的多维度数据分析，表明18种信号蛋白对AD具有良好的预测效果，具有作为AD诊断标志物的潜力[8]。

　　抗体芯片技术可用于辅助研究AD的发病机制。Philipp A. Jaeger等[9]运用抗体芯片技术对AD相关的信号通路及其分子网络进行了研究，并在此基础上开展了基因组和转录组分析，通过多组学数据整合分析进一步阐述了AD相关疾病信号通路。研究发现生长分化因子(GDF)信号通路与AD的发生具有显著相关性，且该结果在AD病人脑组织中也得到了验证。抗体芯片技术还可用于AD治疗相关药物的研究。在2019年上市的全球首个糖类抗阿尔兹海默症创新药物GV-971的药效及其作用机制的研究中，研究者发现在AD病人肠道微生物的失调可引起血液系统中苯丙氨酸和异亮氨酸的水平升高，进而导致炎性反应辅助性免疫细胞Th1的增殖。而Th1细胞可以激活神经小胶质细胞，引起神经系统炎症。与该发现相一致的是，在转基因AD模型小鼠脑组织内大量细胞因子水平发生了显著上调，而当用GV-971处理模型小鼠后则发现小鼠脑组织中细胞因子的水平较野生型小鼠发生了显著下调[10]。

　　2. 心血管疾病研究：基于抗体芯片技术的蛋白质组学研究被用于急性心肌梗死诊断标志物的发现[11]。急性心肌梗死(AMI)是一种严重威胁人类生命健康的疾病，其常见症状是胸痛、左肩痛、呼吸短促等，但据估计仍有多达64%的急性心肌梗死患者无症状。因此，对AMI的早期诊断标志物进行研究是非常有必要的。AMI的特征性心电图表现有两种：ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死。ST段抬高型心肌梗死病人易合并心律失常、心力衰竭、心源性休克等。Zhang Y等人对10例正常对照和10例ST段抬高型心肌梗死(STEMI)人群的血清样本进行了研究，芯片分析结果显示，有21个蛋白在STEMI病人血清中差异表达，其中10个因子在STEMI病人血清中表达显著升高，11个因子在STEMI病人血清中表达显著下降。进一步对其中的差异蛋白BDNF、MMP9和PDGF-AA进行ELISA验证，结果与芯片数据一致。ROC曲线分析表明BDNF、MMP9和PDGF-AA对于STEMI的诊断均具有较好的灵敏度和特异性。

　　基于抗体芯片技术的蛋白质组学研究被用于心力衰竭疾病诊断标志物的发现[12]。有研究者对正常人、高血压病人和舒张性心衰(HFPEF)病人用标记法抗体芯片进行了分析，结果显示，59个蛋白在HFPEF病人血清中表达比健康人血清中显著升高，17个蛋白在HFPEF病人血清中表达较高血压病人血清中显著升高。而将健康组和高血压组数据合并做为Non-HFPEF组，并将HFPEF组与Non-HFPEF组数据对比，发现有14个蛋白在HFPEF组上调，3个蛋白在HFPEF组下调。用这17个差异蛋白做聚类分析，可以将Non-HFPEF和HFPEF很好的区分。在所有上述比较中均发现angiogenin在心衰人群中升高显著，因此对angiogenin在扩大数量的样本中进行了ELISA验证，结果与芯片数据一致，且ROC分析表明angiogenin对HFPEF具有很好的灵敏度和特异性，提示angiogenin可能作为HFPEF诊断标志物。

　　3. 肿瘤研究：抗体芯片在多种肿瘤标志物发现研究中具有广泛的应用，如应用于胰腺癌肿瘤标志物发现[13-15]，应用于结直肠癌标志物发现[16]，应用于卵巢癌肿瘤标志物发现[17]等。抗体芯片技术可用于肿瘤耐药机制研究。Ho-June Lee等用EGFR激酶特异性抑制剂Erlotinib处理人肺腺癌细胞 PC-9构建耐药肿瘤细胞模型，之后对耐药细胞培养基上清中的细胞因子进行分析，以研究肿瘤细胞的耐药性机制。结果显示，Galectin-3、ErbB3、EDA-A2等十几种细胞因子在耐药模型细胞上清中表达量升高，其中IL-6，IL-1a，Galectin-3是能够激活Stat3通路的关键因子，推测可能是Stat3通路的激活促进了PC-9细胞的耐药性产生。之后通过WB检测、基因芯片分析以及肿瘤移植研究，进一步证实Stat3通路对肿瘤细胞耐药性具有促进作用。本研究提示，对Stat3反馈通路进行抑制有可能可以提升许多抗肿瘤药物的抑癌作用[18]。

　　抗体芯片技术还可用于肿瘤转移机制的研究。肿瘤浸润细胞被认为具有肿瘤抑制活性，但越来越多的证据却表明肿瘤浸润免疫细胞也可能分化成为具有促进肿瘤生长和转移能力的细胞。肿瘤浸润细胞分为单核细胞特征细胞(MDSCs)和粒细胞特征细胞(MDSCs)两大类，为了阐明这两类细胞在肿瘤转移过程中的不同功能，Maria Ouzounova等人对这两类细胞进行了研究。通过对转移性乳腺癌细胞4T1和低转移性乳腺癌细胞EMT6分别构建的小鼠肿瘤模型进行细胞因子的分析，发现与非转移性肿瘤细胞相比，转移性肿瘤细胞可分泌更高水平的炎症细胞因子，包括IL6、IL8、RANTES、G-CSF、GMCSF、IL12、CXCL16、CXCL5和VCAM等趋化因子。这些细胞因子可能是促进肿瘤细胞转移的原因。通过对肿瘤移植病人的分析、细胞共培养、构建不同肿瘤移植小鼠模型等一系列研究，结果表明mMDSCs可能通过诱导原位肿瘤细胞的EMT/CSC化而获得转移能力，而gMDSCs则通过促进肿瘤的增殖而发生转移。本研究提示，炎性细胞因子是促进细胞EMT化的重要因素[19]。此外，Anders Carlssona等人对64例原发性乳腺癌病人血清样本中的免疫调节蛋白在手术前及手术后不同时间的变化进行了分析，其中手术后病人有些发生了转移。芯片结果提示，IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、IL-18、IL-12α等21种免疫调节蛋白在乳腺癌手术后发生了动态变化，其中术后未转移病人动态下调，而转移病人则呈现动态上调。这一结果在另一组26个病人中得到了验证。本研究的一系列数据表明21种免疫调节蛋白具有作为乳腺癌预后及转移预测标志物的潜在可能[20]。

　　四、展望

　　抗体芯片作为一种特殊的蛋白质芯片，可以对细胞、组织、体液等各种样本类型中的蛋白质组进行定性和定量分析，具有通量高、灵敏度好、实验过程简单等技术优势，经过十多年的发展，该技术目前已经非常成熟，在各类生命科学研究中得到了广泛应用。

　　毫无疑问，在衰老及衰老相关疾病的研究中，抗体芯片技术也因其独特优势而得到了大量运用，并发挥了重要作用。从我们整理的文献来看，在衰老及衰老相关疾病研究领域中，抗体芯片技术多用于研究细胞因子表达量的变化，而对于修饰的研究应用则较少见，此外，相关研究主要着眼于细胞模型或动物模型，而较少运用在临床病例的研究，因此作者认为，未来在修饰谱研究和临床队列的研究方向上，基于抗体芯片的蛋白质组技术将可以发挥更为重要的作用。